INVESTIGACIÓN DOCUMENTAL

REGULACIÓN POSTRANSCRIPCIONAL DE LOS GENES AFLR  Y VEA, IMPLICADOS EN LA RUTA METABÓLICA DE AFLATOXINAS, MEDIANTE RNAi EN ASPERGILLUS FLAVUS NRRL3357.

Antecedentes

Las aflatoxinas (AF) son metabolitos secundarios producidos por varios hongos del genero Aspergillus sección flavi, principalmente por cepas de A. flavus, A. parasiticus, aunque también se han encontrado en presencia de  A. nomius. (Cota, 2010)

Se han identificado distintas enzimas involucradas en la biosíntesis de aflatoxinas, pertenecientes a  A. flavus y A. parasiticus, entre las que destacan la activación de genes de la ruta biosintética de aflatoxinas que es regulada por el factor de transcripción aflR. Por otra parte en el  gen veA se ha observado que su deleción en cepas de A. flavus y A. parasiticus provoca la pérdida de la habilidad para producir aflatoxinas. (Bbosa, 2013)

El silenciamiento génico como herramienta para desarrollar nuevas variedades de organismos capaces de inhibir la producción de aflatoxinas parece ser una técnica prometedora. El objetivo de este trabajo es disminuir los niveles de expresión de los genes aflR y veA utilizando tecnología de RNAi.  (Carvajal, 2013)

Objetivo General 

·   Transformar  genéticamente la cepa Aspergillus flavus NRRL3357  mediante tecnología de RNAi para reprimir la expresión de los genes aflR y veA, implicados en la ruta metabólica de aflatoxinas.

Objetivo Particular 

• Obtener las construcciones de los genes veA y aflR  en los vectores de entrada y vectores de expresión.
• Comprobar la inserción de los ORF de veA y aflR y analizar el sentido de la ligación.
• Obtener dsRNA y transformar protoplastos a partir de la cepa Aspergillus flavus NRRL3357.
• Transformar  la cepa Aspergillus flavus NRRL3357 mediante Agrobacterium tumefaciens cepa AGL1.
• Cuantificar  los niveles de expresión por qRT-PRC y analizar los datos.
• Comparar la morfología macroscópica y microscópica de la cepa tratada contra la cepa control. 

                                                                       Hipótesis

    El silenciamiento génico de los ORFs de los genes aflR y veA por tecnología de RNAi en Aspergillus flavus NRRL3357 disminuirá sus niveles de expresión.

   Diseño del plan de trabajo

Metodología

1. Obtención de los genes aflR y veA en los vectores de entrada 

1.1 Amplificación de los ORFs

1.2 Clonación del ORF en  vectores de entrada

1.3 Transformación  de Escherichia coli  DH5α por choque térmico

1.4 Extracción de plásmido por lisis alcalina

1.5  Determinación de  la orientación y confirmación del inserto

2.  Silenciamiento genético por transfección de protoplastos con dsRNA

2.1 Crecimiento de la cepa de Aspergillus flavus NRRL3357

2.2 Obtención de protoplastos

3.  Transformación genética vía Agrobacterium tumefaciens   

3.1  Linealización de las secuencias en el vector pCR™8/GW/TOPO®

3.2  Subclonación  del ORF en el vector de expresión pB2GW7

3.4 Extracción de plásmido y comprobación de la inserción del ORF 

3.5 Crecimiento de la cepa de Aspergillus flavus NRRL3357

3.6 Determinación de la concentración fúngica

3.7 Inoculación de Asperguillus flavus NRRL3357 en medio YES

3.8 Crecimiento de  las clonas de Agrobacterium tumefaciens AGL1 transformadas

3.9 Pre-inducción del T-DNA en Agrobacterium tumefaciens

3.10 Transformación de colonias de Aspergillus flavus NRRL3357 mediante Agrobacterium tumefaciens AGL1

4 Análisis del silenciamiento génico  de conidias transformadas por Agrobacterium tumefaciens AGL1

4.1 Extracción de RNA a partir de las conidas transformadas

4.2 Preparación de las muestras de RNA para qRT- PCR.

4.3 Análisis del silenciamiento génico  por el método ddC_T

4.4 Análisis del silenciamiento génico en la morfología

Referencias

• Bbosa, G. Kitya, D., Jasper, J. 2013. Aflatoxins metabolism, effects on  epigenetic mechanisms and their role in carcinogenesis. Health, 5 (10):14–34.
• Calvo, A. M. 2008. The VeA regulatory system and its role in morphological  and chemical development in fungi. Fungal Genetics and Biology, 45(7):1053–1061.
• Carvajal, M. 2013. Transformación de la aflatoxina B1 de alimentos, en el cancerígeno humano, aducto AFB1-DNA. TIP. Revista Especializada en Ciencias Químico-Biológicas, 16 (2): 109–120.
• Cota, O. 2010. Elaboración de quitosano a partir de desechos de camarón y evaluación de sus propiedades antifúngicas ante Aspergillus parasiticus y su producción de aflatoxina B1. Tesis (Maestro en Ciencias). Sonora, Universidad de Sonora. 121.
• Dang, Y., Yang, Q., Xue, Z., Liu, Y. 2011 RNA interference in fungi: Pathways, functions, and applications. Eukaryotic Cell. 10 (9):1148-1155.
• Dutt, M., & Grosser, J. W. 2009. Evaluation of parameters affecting Agrobacterium-mediated transformation of citrus. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), 98(3): 331–340.
• FAO. 1997. Mycotoxins in Grain. Department of Agriculture and Consumer Protection. [En línea] Consultado el 1 de junio del 2015. Disponible en http://www.fao.org/wairdocs/x5008e/x5008e01.htm